ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ

МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Микробы представляют собой мельчайшие организмы, стоящие на низших ступенях развития. Большинство из них одноклеточные, хотя встречаются и многоклеточные. Размеры их обозначают в микронах (1 мкм = микрометр = миллионная часть метра = тысячная часть миллиметра) или в 1000 раз более мелкой величиной — в нанометрах (нм = миллионная часть миллиметра). Одни микробы имеют величину, измеряемую нанометрами,, другие — единицами и десятками микрометров, третьи — долями миллиметра.

Различают следующие важнейшие группы микробов: бактерии, риккетсии, вирусы, грибы, дрожжи, простейшие.

Бактерии — одноклеточные организмы растительной природы, лишенные хлорофилла и обладающие рядом физиологических особенностей. Они бывают подвижными и неподвижными, размножаются делением и имеют размеры 0,3—5 мкм. По внешнему виду бактерии делятся на три формы: палочковидные, шаровидные (кокки) и извитые (вибрионы и спириллы).

Кокковые формы различаются по форме деления и расположению в мазках. Они делятся в одной, двух, трех и более взаимно перпендикулярных плоскостях. При делении в одной плоскости они располагаются парами (диплококки) или цепочками (стрептококки); в двух плоскостях — по четыре (тетракокки), в трех плоскостях образуют пакеты (сарцины); при беспорядочном делении располагаются одиночно (микрококки) или в виде гроздьев винограда (стафилококки) (рис. 1).

Рис. 1. Основные формы бактерий: 1 — стафилококки; 2,3 — диплококки; 4 — стрептококки; 5 — тетракокки; 6 - сардины; 7,8 — палочки, не образующие спор; 9 — палочки, образующие споры; 10 — вибрионы; 11 — спириллы; 12 — спирохеты

Извитые формы имеют вид спирали. Некоторые из них представляют собой часть витка спирали (вибрионы), другие — витки спирали с большим диаметром (спириллы) и с малым диаметром (спирохеты).

Палочковидные формы бактерий, подобно коккам, располагаются по длине парами — диплобактерии или цепочками — стрептобактерии. Палочковидные формы могут быть прямые и искривленные, строго цилиндрические и неравномерно утолщенные, с концами закругленными, заостренными или обрубленными.

Строение бактерий. Клетки бактерий состоят из ядра, цитоплазмы и оболочки. Некоторые бактерии, кроме того, имеют жгутики, капсулу и образуют споры.

Ядро бактерий в отличие от ядра клеток растений и животных не имеет ядерной мембраны и типичных хромосом и поэтому его называют нуклеоидом, или хроматиновым тельцем. Оно состоит из мельчайших частиц хроматина — дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Бактериальные клетки, не имеющие ядерной мембраны, называют прокариотами (от греч. про — вместо, карион — ядро, означает клетка с иными образованиями).

Цитоплазма бактерий — прозрачная, вязкая, состоит из белков, жиров, углеводов и других органических соединений, минеральных веществ и воды.

Оболочка бактерий — плотное эластичное образование, придающее бактерии постоянную форму. Она состоит из белков и углеводно-липоидного комплекса.

Капсула бактерий — слой, представляющий разрыхленную поверхность бактериальной оболочки. Капсула состоит в основном из сложных полисахаридов и воды (до 98%) и служит осмотическим барьером при обилии жидкости или высушивании. Она защищает болезнетворные бактерии от фагоцитов. Капсулу выявляют с помощью негативной окраски тушью или протоплазматическими красителями (см. ниже).

Жгутики — очень тонкие белковые извитые фибриллы — нити, начинающиеся на внутренней стороне оболочки бактерий. Многие бактерии не имеют жгутиков.

Бактерии, имеющие только один жгутик, называют монотрихами. У некоторых бактерий жгутики расположены в виде пучка на одном конце, такие бактерии называют лофотрихами; у других жгутики отходят со всех сторон клетки, их называют перитрихами (рис. 2). При помощи жгутиков бактерии активно передвигаются. Монотрихи и лофотрихи перемещаются прямолинейно, стремительно, перитрихи — медленно, совершая вращательные движения. Бактерии, не имеющие жгутиков, могут передвигаться только пассивно с током жидкости. Им присуще так называемое броуновское движение.

Рис. 2. Бактерии с различным расположением жгутиков: а — монотрихи; б — лофотрихи; в — перитрихи

Споры бактерий — овальные или сферические тельца с густой, сильно преломляющей свет цитоплазмой и толстой оболочкой, состоящей из нескольких слоев; образуются из вегетативных форм бактерий. Спорообразование свойственно только некоторым палочковидным бактериям. Оно происходит при неблагоприятных условиях и длится 16—24 ч. Споры позволяют бактериям сохраняться длительное время во внешней среде. Бактерии в состоянии спор становятся стойкими к высушиванию, облучению, гниению и могут сохраняться десятки лет. Палочковидные бактерии, образующие споры, называют бациллами (Bacillus), а не образующие споры—бактериями (Bacterium).

Химический состав микроорганизмов. Они содержат 45—50% белков, 10—35 углеводов, 2—25 жиров и 5—25% нуклеиновых кислот (РНК или ДНК). Кроме того, в их состав входят в небольших количествах другие органические соединения и минеральные соли.

В процессе роста некоторые бактерии образуют биотики и пигменты. Эти вещества являются продуктами их обмена. Антибиотики тормозят развитие многих других видов бактерий. Вещества, выделяемые бактериями, в большинстве своем бесцветные соединения. Пигменты, выделяющиеся в виде бесцветных соединений, называются лейкобазами. Эти продукты при окислении окрашиваются. Например, Pseudomonas aeruginosa выделяет бесцветный феназин, дающий при окислении антибиотик-пигмент пиоцианин. Дыхательный пигмент бактерий цитохром, аналогичный гемоглобину человека, не придает бактериям окраски, а бактериохлорофилл, содержащийся в фотосинтезирующих бактериях, окрашивает их в зеленый или фиолетовый цвет.

Вирусы — самые мельчайшие живые существа, проникающие через асбестовые или фарфоровые (каолин) фильтры, задерживающие бактерии. По размерам они приближаются к наиболее крупным белковым молекулам. Измеряются вирусные частицы нанометрами, размер вирусов средней величины 60—120 нм.

Частичка вируса — вирион — состоит только из одной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белковой частицы и является внутриклеточным паразитом. Вирусы могут размножаться только внутри живой размножающейся клетки. Они паразитируют в клетках тканей животных, растений, человека и в микроорганизмах. Вирусы, развивающиеся в микроорганизмах, называются бактериофагами (пожирателями бактерий).

Вирусы имеют шаровидную, кубическую, палочковидную и нитевидную формы. Некоторые вирусы внутри пораженных клеток образуют тельца-включения.

Риккетсии занимают промежуточное место между вирусами и бактериями. Они, как и вирусы, внутриклеточные паразиты. Риккетсии поражают в основном клещей и насекомых, но имеются и патогенные для человека и теплокровных животных. Размеры их 0,1—0,5×0,3—1,0 мкм. Известны формы кокковые, палочковидные и нитевидные.

Грибы (Fungi) относятся к эукариотам (от греч. эу — истинный, карион — ядро). Они значительно крупнее бактерий и имеют более дифференцированное строение. Клетки грибов достигают 10—50 мкм в длину и в среднем 5—8 мкм в поперечнике. Они состоят из ядра, цитоплазмы и оболочки. Клетки гриба примыкают друг к другу, образуя нити — гифы. Бывают гифы очень длинные, состоящие всего из одной клетки. Сплетение гифов в питательной среде называется мицелием (грибницей). Часть гифов возвышается над поверхностью среды, образуя воздушный мицелий.

Размножаются грибы почкованием (бесполое размножение) и аскоспорами (споровое размножение). При бесполом размножении на плодоносящих гифах-конидиеносцах формируются конидии (споры бесполого размножения). Аскоспоры образуются после полового слияния двух клеток. Оболочка в местах соприкосновения растворяется, и часть цитоплазмы переходит из одной клетки в другую. После полового слияния происходит двух- или трехкратное деление, в результате чего образуется 4—8 аскоспор. Споры грибов, таким образом, в отличие от спор бактерий служат целям размножения. Споры грибов менее устойчивы, чем споры бактерий.

Грибы делятся на группы:

фикомицеты (Phycomycetes),

аскомицеты (Ascomycetes) и несовершенные (Fungi imperfecti или Deuteromycetes).

Фикомицеты, или мукоровые грибы, образуют одноклеточный несептированный, т. е. без перегородок, ветвистый мицелий с шарообразным или булавовидным плодовым телом, наполненным спорами.

Аскомицеты — грибы многоклеточные, септированные (разделенные перегородками), образуют сумки; к ним относятся аспергиллы, пенициллы и дрожжи.

Аспергиллы (Aspergillus), или леечные грибы. Ко-нидиеносцы их располагаются по шару радиусами, в виде струи воды из лейки (отсюда и название). Конидии разных видов аспергиллов бывают окрашены в желтый цвет (Aspergillus flavus), черный (A. niger), светло-зеленый (A. glaucus) и т. д.

Пенициллы (Penicillium), или кистевики, имеют строение конидиеносцев с конидиями в виде кисточки (рис. 3).

Рис. 3. Плесневые грибы: а — пенициллы; б — аспергиллы; в — мукор

Дрожжи, или дрожжевые грибы, имеют овальные крупные клетки диаметром 8—10 мкм. Размножаются они чаще делением или почкованием. При истощении питательной среды происходит половое размножение с помощью аскоспор. Различные виды дрожжей определяют по форме вегетативных клеток, почкующихся клеток и аскоспор. Дрожжи не образуют мицелия.

Несовершенные грибы не имеют плодовых тел. Половой способ размножения у них неизвестен. Размножаются они путем дробления или бесполого спорообразования.

Простейшие (Protozoa) — это одноклеточные организмы со сложным жизненным циклом развития. Их размеры 6—20 мкм и более. Клетки имеют цитоплазму и четко выраженное ядро (эукариот).

Цитоплазма на поверхности может быть уплотненной (эктоплазма). Многие простейшие имеют оболочки и образуют споры или цисты. Некоторые простейшие снабжены жгутиками или ресничками, позволяющими им передвигаться.

Простейшие, лишенные оболочки, передвигаются с помощью выпячивания псевдоподии, или ложноножек, и переливания в нее всей цитоплазмы. Простейшие делятся на 4 класса (рис. 4):

Рис. 4. Простейшие: а — саркодовые; б — жгутиковые; в — ресничные; г — споровик

1 — саркодовые (Sarcodina), или амебы, передвигаются с помощью псевдоподий; при неблагоприятных условиях образуют плотные цисты;

2 — жгутиковые (Mastigophora) перемещаются с помощью длинных нитевидных отростков, к ним относятся трипаносомы и лептомонас;

3 — споровики (Sporozoa) передвигаются на ранних стадиях развития с помощью псевдоподий, к ним относятся микроспоридии, в том числе позема;

4 — ресничные (Ciliata) перемещаются с помощью ресничек, к ним относятся парамеции (туфельки), питающиеся сапрофитно, т. е. продуктами разложения органических веществ.

ЛАБОРАТОРНЫЕ ЗАНЯТИЯ

Для определения видов микробов применяют четыре метода исследования: 1) бактериоскопический, или метод микроскопирования; 2) бактериологический, или метод чистых культур; 3) метод опытных заражений и 4) серологический.

Микроскопический метод исследования

Микроскоп, красители и приготовление препаратов. 1. Освоить правила обращения с микроскопом. 2. Изучить приемы приготовления красящих растворов. 3. Приготовление препаратов.

Оборудование и материалы: микроскопы (по одному на учащегося); сухие красители (основной фукцин, сафранин, генциаквиолет, метиленовая синь и спиртовые их растворы); одна бактериологическая петля, спираль, флакон с кедровым маслом, три листка фильтровальной бумаги, набор красящих растворов, банка с обезжиренными предметными стеклами и восковой карандаш (из расчета на учащегося); пробирки с суспензией стафилококка, стрептококка, сарцины, кишечной палочки и сенной палочки; стеклянные банки с 2%-ным раствором фенола; таблица (расположение и формы микроорганизмов).

Освоение правил обращения с микроскопом.Микроскоп обычный световой, имеет штатив, подвижной столик, макроскопический винт, микроскопический винт, зеркало, конденсор с ирисовой диафрагмой, окуляры и объективы со слабым, средним и сильным увеличением (рис. 5). Объектив с сильным увеличением называется иммерсионным, так как для исследования с его помощью для лучшей видимости микроорганизма на препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Объектив опускают в иммерсионное масло и исследуют. На окулярах и объективах имеются цифры. Общее увеличение микроскопа определяют умножением показателя увеличения поставленных в рабочее положение окуляра и объектива.

Рис. 5. Микроскоп МБР-1: 1 — башмак; 2 — макрометрический винт; 3 — коробка с микромеханизмом; 4 — тубусодержатель; 5 — головка тубусодержателя; 6 — монокулярный тубус; 7 — окуляр; 8 — винт для крепления тубуса; 9 — винт для фиксации револьвера; 10 — револьвер; 11 — объективы; 12 — предметный столик; 13 — конденсор; 14 — стопорный винт конденсора; 15 - рукоятка ирисовой диафрагмы; 16 - винт для перемещения конденсора; 17 — зеркало; 18 — микрометрический винт; 19 — стопорный винт верхней части столика; 20 — центрировочный винт для установки препарата

Столик микроскопа имеет боковые винты, позволяющие передвигать аппарат в разные стороны. Под столиком находится конденсор — система линз. Конденсор поднимают вровень со столиком при работе с иммерсионной системой и опускают ниже при работе с объективами со средним и слабым увеличением. Конденсор имеет ирисовую диафрагму, позволяющую регулировать освещение. При работе с иммерсионной системой диафрагму полностью открывают. Ниже конденсора находится плоское — вогнутое вращающееся зеркало. Днем окрашенные препараты освещают с помощью плоского зеркала, при слабом освещении пользуются вогнутым зеркалом. После окончания работы тубус микроскопа поднимают, убирают препарат и чистой марлей, смоченной бензином, снимают иммерсионное масло. Микроскоп хранят в футляре или под стеклянным колпаком с целью защиты от загрязнений.

Специальные микроскопы имеют фазово-контрастное устройство, позволяющее четко видеть микроорганизмы и их внутреннее строение без окраски благодаря их различной оптической плотности.

Флуоресцентный микроскоп основан на исследовании микроорганизма в волнах света короткой длины, чаще в свете ультрафиолетовых лучей. Исследование проводят при сильном источнике света, например вольтовой дуге. Применяют светофильтры, не пропускающие видимый свет.

Бактерии обрабатывают особыми красками — флуорохромами. Для этого микроорганизмы промывают 2—3 раза прокипяченной водой для удаления питательной среды, готовят препарат, сушат при комнатной температуре, фиксируют на пламени спиртовки и красят несколько минут слабыми растворами флуоресцирующих красителей. После высушивания устанавливают препарат на предметный столик микроскопа и освещают коротковолновыми лучами. Наблюдают через окуляр с желтым светофильтром. Между источником света и зеркальцем микроскопа ставят синий светофильтр, пропускающий только лучи, возбуждающие флуоресценцию. При отсутствии микроба или других объектов, обладающих флуоресценцией, свет через фильтры не проходит, так как лучи, проникающие через первый фильтр, будут поглощаться вторым. При наличии флуоресцирующих объектов свет флуоресценции пройдет через оба светофильтра и сделает препарат видимым.

Электронный микроскоп дает возможность изучить мельчайшие частички, приближающиеся по размерам к молекуле белка. Вместо источника света в нем используются электроны вольфрамовой нити, а вместо оптических линз обычного микроскопа—электромагнитные. Для регулирования движения электронов имеются две катушки, создающие сильное электромагнитное поле. Они концентрируют и рассеивают электроны. Первая катушка выполняет роль окуляра, вторая — объектива. Изображения получают на специальном экране.

Приготовление красителей. Красящие растворы готовят из анилиновых красителей. Красители бывают основные (щелочные) и кислые. Кислые красители легко окрашивают элементы клеток, имеющие щелочную реакцию, конкретно протоплазму, поэтому их называют протоплазматическими. Кислые красители бактерий не окрашивают. Употребляют их лишь для прокрашивания фона препарата.

Основные красители окрашивают ядра клеток, поэтому их называют ядерными. Бактерии окрашиваются почти исключительно основными красителями.

Важнейшие основные красители: красные — нейтральрот, пиронин, сафранин, фуксин основной; фиолетовые — генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет, тионин; синие — метиленовая синь, виктория; зеленые — малахитовая зелень, метиловая зелень; коричневые — везувин, хризоидин; черный — индулин.

Главные кислые красители: красные — кислый фуксин, эозин; желтые — ауранция, пикриновая кислота; черный — нигрозин. Красители имеют вид порошков или кристаллов, для окраски микробов из них готовят водные и спиртовые растворы.

Водный раствор кристаллвиолета. К 0,3 г красителя добавляют 100 мл дистиллированной воды, раствор фильтруют. Применяют для окраски по Граму. Раствор не дает осадка.

Водный раствор метилвиолета. Берут 1 г красителя в порошке и растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр. Окраска по Граму.

Водный раствор нейтральрота. 1 г красителя в порошке растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр. Окраска по Граму.

Водный раствор сафранина. 2 г краски насыпают на бумажный фильтр и заливают 100 мл горячей дистиллированной воды.

Водные растворы могут медленно, слабо и быстро портиться. Готовить их нужно в небольших количествах, хранить в темных склянках. Для усиления действия красителей применяют протравители: фенол, едкую щелочь, йод, спирт, формалин и другие химические вещества, которые повышают окрашиваемость микробов. Действие протравителей различно. Они или уплотняют протоплазму бактерий, или мацерируют слишком плотную их оболочку, способствуя проникновению красителя (щелочь), или осаждают краситель в протоплазме клетки. Окрашиваемость микробов также повышается при подогревании, повышении концентрации красителя, увеличении времени окрашивания (до нескольких часов).

Спирто-водные растворы красителей применяют чаще, так как они быстро окрашивают микробные клетки и долго сохраняются. Спирто-водные растворы готовят в два приема. Вначале готовят (на 1 год и более) спиртовые насыщенные растворы красителей. Для этой цели к 1 г краски добавляют 9 мл этилового 96%-ного спирта. Из насыщенных спиртовых растворов красителей готовят рабочие спирто-водные растворы. К 1 мл насыщенного спиртового раствора прибавляют 9 мл дистиллированной воды. Для усиления действия краски к дистиллированной воде добавляют какой-нибудь вышеуказанный протравитель. Приготовленные растворы ставят в теплое место (термостат) на 1—2 сут для лучшего растворения краски, после чего фильтруют через плотный бумажный фильтр и лишь тогда применяют для окрашивания мазков.

Феноловый фуксин Циля. К 1 г основного фуксина в порошке приливают 10 мл спирта-ректификата. Смесь оставляют на сутки в комнате для получения насыщенного спиртового раствора фуксина. После этого к насыщенному раствору краски прибавляют 90 мл 5%-ного раствора кристаллического фенола, приготовленного на дистиллированной воде. Через сутки красящий раствор фильтруют через бумажный фильтр и разливают по флаконам. Фуксин Циля — стойкий краситель к сохраняется длительное время. Этот краситель употребляют для окрашивания спор и кислотоупорных бактерий. 2%-ный феноловый фуксин готовят из одной части фуксина Циля и 1,5 части воды; употребляют для окраски мазков из тканей. Вегетативные формы будут ярко-красные, а споры — розовые.

Фуксин Пфейффера готовят из фенолового фуксина Циля: берут одну часть фуксина Циля и разбавляют девятью частями дистиллированной воды. Краситель нестойкий, поэтому его употребляют в свежеприготовленном виде.

Феноловый генцианвиолет. К 1 г генцианвиолета приливают 9 мл спирта-ректификата, смесь оставляют на сутки в комнате для получения насыщенного спиртового раствора красителя. К полученному спиртовому насыщенному раствору генцианвиолета прибавляют 100 мл 2%-ного раствора кристаллического фенола. Через сутки красящий раствор фильтруют через бумажный фильтр и разливают по флаконам. Феноловый генцианвиолет хранится долго. Применяют при окраске микробов по способу Грама.

Метиленовая синь Леффлера. К 3 г метиленблау в порошке приливают 30 мл спирта-ректификата. Смесь оставляют на сутки в комнате для получения насыщенного спиртового раствора красителя. После этого к полученному насыщенному раствору сини приливают 100 мл 0,01%-ного водного раствора едкого калия. Через сутки красящий раствор фильтруют.

Раствор Люголя. В 5 мл дистиллированной воды растворяют сначала 2 г йодистого калия, а затем 1 г кристаллического йода. После растворения йода прибавляют 295 мл дистиллированной воды и фильтруют. Готовят раствор для окраски бактерий по Граму.

Приготовление препарата. Предметные и покровные стекла должны быть совершенно чистыми и обезжиренными. Нанесенная на сухое стекло капля воды должна расплываться. Стекла, не бывшие в употреблении, моют, затем кипятят в 1%-ном растворе соды, обмывают водой, Далее 2%-ным раствором соляной кислоты и снова водой. Использованные стекла после кипячения натирают мылом или моют моющим порошком и вытирают насухо марлей. Пипетки пастеровские готовят сами по мере надобности. Для этого стеклянные трубки длиной 20 см моют, сушат, с обоих концов вставляют ватные тампоны и стерилизуют. Затем середину этих трубок сильно нагревают на огне, непрерывно вращая, вытягивают и концы запаивают. Получаются пипетки. При пользовании пипеткой часть тонкого конца обламывают и набирают исследуемый материал.

Пипетки или иглы готовят из платиновой или никелевой проволоки. Проволоку длиной 8—10 см вставляют в специальный иглодержатель или впаивают в конец стеклянной палочки. Петлю готовят путем загиба конца проволоки в замкнутое кольцо диаметром 3 мм. Петлю (иглу) перед взятием материала фламбируют (прокаливают) на огне спиртовки.

Чтобы приготовить препарат, берут обезжиренное стекло и на обратной его стороне делают карандашом надпись номера экспертизы и другие обозначения. Затем на стекло наносят каплю физраствора. После этого захватывают петлей из тканей насекомого или чистой культуры небольшое количество материала и вносят в каплю на стекло. Осторожными круговыми движениями каплю распределяют петлей по стеклу в виде овала. При этом надо следить за тем, чтобы капля солевого раствора только помутнела. Остаток культуры на петле сжигают на пламени спиртовой горелки. Распределять взвесь по стеклу следует весьма осторожно, чтобы не изменить естественного расположения микробов (гроздья, цепочки и пр.). Мазки высушивают при комнатной температуре, а не на горелке, так как при ускоренной отдаче воды микробные клетки деформируются (изгибаются, укорачиваются, обугливаются). Особенно не рекомендуется сушить над пламенем мазки из тканей.

Фиксация препарата на огне. После высушивания препаратов с мазками их фиксируют. Цель фиксации — прикрепить микроорганизмы к стеклу и убить их, т. е. сделать обращение с ними безопасным и создать условия, способствующие лучшей окраске мазка. Наиболее простым способом фиксации мазков является подогревание их на пламени спиртовки. При фиксации пламенем препарат держат большим и указательным пальцами правой руки1 за края стекла у того его конца, где написан номер. Стекло проводят через пламя мазком вверх неторопливыми движениями. При недостаточном нагревании мазок будет плохо зафиксирован и при окрашивании смоется водой. На плохо зафиксированном мазке при нанесении капли масла микробы всплывают, что затрудняет исследование. При перегревании изменяется форма микроба.

Фиксация препарата спирт-эфиром. Более совершенная фиксация достигается погружением мазка в смесь из равных частей этилового спирта и эфира. Можно эту смесь наливать на мазок и держать до испарения. Такая фиксация обычно рекомендуется для мазков из тканей, особенно содержащих микроорганизмы.

Изучение микробов. 1. Освоить методы окраски мазков по Граму, капсул, спор и негативный способ окраски. 2. Исследовать неокрашенные мазки. 3. Освоить способ измерения микроорганизмов.

Оборудование и материалы: микроскопы (по одному на студента); бактериологическая петля, спиртовка, кедровое масло, шесть листков фильтровальной бумаги, банка с обезжиренными стеклами, обезжиренные покровные стекла и восковой карандаш, 2%-ный феноловый раствор генцианвиолета, раствор Люголя, 70%-ный спирт, водный раствор сафранина, щелочной раствор метиленовой сини Леффлера, карболовый фуксин Циля — Нильсена, черная тушь, взвеси бактерий кишечной палочки, стафилококка; расплод, пораженный гнильцом; мертвые пчелы, погибшие от нозематоза; стеклянные банки с 2%-ным раствором фенола для погружения отработанных материалов, таблицы окраски по Граму, окулярный и объективный микрометры.

Методы окраски мазков.Простая окраска. Для окрашивания препаратов используют простые и специальные способы окрашивания. Простая окраска применяется для общего ознакомления с формой, размерами и расположением микроорганизмов. На высушенный и фиксированный мазок наносят с помощью пипетки и резинового баллона несколько капель красителя так, чтобы последний покрывал с избытком весь мазок. Для простой окраски чаще всего употребляют метиленовую синь, сафранин или водный фуксин Пфейффера. Краску держат на препарате 2—3 мин и затем смывают водой. Окрашенные мазки тщательно высушивают между листами фильтровальной бумаги. На совершенно сухой препарат наносят каплю кедрового масла и исследуют под микроскопом через иммерсионный объектив. Формы и расположение микроорганизмов зарисовывают в тетрадь.

Окраска по Граму позволяет делить микроорганизмы на две группы: грамположительные и грамотрицательные, что зависит от химического строения бактерий. Грамположительные бактерии обладают способностью прочно удерживать фиолетовый краситель с йодом и не обесцвечиваться спиртом. Грамотрицательные бактерии при таком способе окраски легко обесцвечиваются спиртом.

Обычно для окрашивания употребляют 2%-ный феноловый раствор генцианвиолета. Нередко его заменяют водным раствором кристаллвиолета или метилвиолета. Мазок красят раствором генцианвиолета или кристаллвиолета 2 мин, избыток красителя сливают. Не промывая водой, наносят раствор Люголя на 2 мин, сливают и обрабатывают 90%-ным спиртом-ректификатом в течение 40—45 с. Спирт смывают водой и дополнительно окрашивают фуксином Пфейффера в течение 2 мин. Мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, наносят каплю кедрового масла и смотрят с иммерсией, Грамположительные бактерии сохраняют фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются в красный цвет.

Окрашивание по Граму сопровождают контролями. На предметное стекло наносят три мазка: из испытуемого материала, грамположительных микробов (стафилококки, сенная палочка) и грамотрицательных микробов (кишечная палочка).

Метод Ольта. Некоторые бактерии вокруг себя образуют капсулу. Для выявления ее мазки красят 2%-ным водным раствором сафранина с подогреванием до охлаждения паров. Раствор сафранина готовят перед употреблением. Красят 3 мин, промывают водой, сушат фильтровальной бумагой, наносят каплю кедрового масла и микроскопируют. Микроорганизмы темно-красные, капсулы желтые. Исследуют мазки, приготовленные от недавно погибших личинок европейского гнильца.

Окраска по Цилю — Нильсену. Не красящиеся обычными красителями так называемые кислотоупорные микроорганизмы, а также споры красят по Цилю — Нильсену. Высушивают мазок, фиксируют, окрашивают феноловым фуксином Циля 1—3 мин, подогревая до появления паров, промывают водой, обесцвечивают 2—5 с до исчезновения розовой окраски 5%-ным раствором серной или 15%-ным раствором азотной кислоты, промывают водой, дополнительно окрашивают метиленовой синью 0,5—1 мин.

Споры и кислотоупорные микроорганизмы окрасятся в красный цвет, обычные бактерии — синий.

Негативная окраска заключается в том, что на окрашенном фоне выделяются неокрашенные микроорганизмы. Этот способ применяют чаще для окраски извитых форм микроорганизмов — спирохет, трипаносом (рис. 6). Для негативной окраски используют черную тушь, кислый фуксин и нигрозин. К 2%-ному водному раствору нигрозина для длительного сохранения добавляют 0,4% хлороформа.

Рис. 6. Спирохетообразные тельца жгутиков Вас. larvae при негативной окраске

Исследование микроорганизмов без окрашивания. Исследование микроорганизмов без окрашивания применяют для выявления их подвижности, а также для изучения некоторых групп микроорганизмов, хорошо различимых без окрашивания, например простейших. Подвижность микроорганизмов изучают в висячей и раздавленной капле.

Висячую каплю готовят на специальных предметных стеклах с лункой. На покровное стекло наносят маленькую каплю суспензии из физраствора и микробов. Эту каплю закрывают предметным стеклом с лункой, вокруг которой предварительно наносят тонкий слой вазелина. Покровное стекло накрывают так, чтобы капля оказалась в центре лунки. Благодаря вазелину покровное стекло прилипает к предметному. После этого предметное стекло перевертывают, и капля оказывается висячей.

Установка висячей капли под микроскопом требует выполнения определенных правил, иначе покровное стекло будет раздавлено объективом. Сначала при слабом увеличении, (с опущенным конденсором и полузакрытой диафрагмой) отыскивают край капли, который ставят в центре поля зрения. В таком положении стекло закрепляют зажимами. После этого на покровное стекло наносят каплю кедрового масла, в которую под контролем глаза опускают иммерсионный объектив до соприкосновения со стеклом, затем, медленно поднимая конденсор и усиливая освещение частичным раскрытием диафрагмы, устанавливают фокус. Край капли позволяет быстрее установить иммерсионный объектив в фокусе.

Раздавленную каплю готовят, накрывая покровным стеклом каплю из смеси физиологического раствора и микробов, помещенную на предметное стекло. На покровное стекло наносят каплю кедрового масла и препарат рассматривают под иммерсионной системой микроскопа при слегка затемненном конденсоре.

При массовых исследованиях с целью выявления крупных микроорганизмов (позема), видимых при малых и средних объективах микроскопа, препараты просматривают без покровных стекол. Приготовленному мазку дают высохнуть при комнатной температуре. Затем перед исследованием наносят каплю раствора, которую сразу же стряхивают на фильтровальную бумагу. Оставшийся на поверхности слой раствора заменяет покровное стекло.

В тех случаях, когда приходится готовить много препаратов для исследования одних и тех же объектов, например исследования взрослых пчел и бабочек тутового шелкопряда на нозематоз (пебрину), применяют особые растирательные машины, значительно ускоряющие процесс приготовления мазков. Ступки установлены в особом металлическом штативе. В них кладут трупы пчел или бабочек. В ступки наливают определенное количество раствора. Штатив ставят под растирательную машину, имеющую столько пестиков, сколько ступок в штативе. Пестики автоматически приводят в движение, а после растирания автоматически поднимают их особым рычагом над ступками. Снизу к ним подносят специальные предметные стекла, по форме соответствующие половине круга штатива. Касаются одним таким стеклом одной половины пестиков машины, вторым — другой. Капли суспензии, имеющиеся на пестиках, при прикосновении стекла образуют мазки. На полиэдры и протозои исследуют мазки без фиксации В этих случаях на влажный приготовленный препарат, не давая ему просохнуть, накладывают покровное стекло и исследуют сначала при слабом, а затем при среднем увеличении микроскопа. В таких случаях мазки исследуют под микроскопом при несколько затемненном и опущенном конденсоре.

Измерение микроорганизмов. Для измерения микроорганизмов пользуются окулярным и объективным микрометрами. Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в середине которой нанесена линейка длиной 5 мм, разделенная на 50 частей (рис. 7). Из окуляра вывинчивают глазную линзу и кладут на диафрагму окулярный микрометр. Затем глазную линзу завинчивают. Непосредственные измерения микробов производят окулярным микрометром. При различных сочетаниях объективов и окуляров одно деление окулярного микрометра будет различным. Для определения точных размеров деления окулярного микрометра при данном определенном сочетании объектива и окуляра пользуются вспомогательным прибором — объективным микрометром. Он представляет собой стеклянную или металлическую пластинку, имеющую в центре застекленное отверстие. В центре объективного микрометра нанесена линейка длиной 1 мм, которая разделена на 100 частей. Каждое деление равно 10 мкм. На столик микроскопа кладут объективный микрометр и устанавливают его линейку в поле зрения микроскопа при нужном сочетании объектива и окуляра. Затем совмещают объективную и окулярную линейки и определяют, сколько делений вкладывается в то или иное количество делений объективной линейки. Например, в три деления объективной линейки вкладывается пять делений окулярной линейки. Следовательно, одно деление окулярной линейки будет 30:5=6 мкм.

Рис. 7. Окулярный (а) и объективный (б) микрометры

Контрольные вопросы.

1. Какие формы имеют бактерии?

2 Как делятся кокковые формы бактерий?

3. Что такое капсула и каково ее происхождение?

4. Что собой представляет спора и каково ее строение?

5. Почему спора обладает высокой устойчивостью в сравнении с вегетативной формой бактерий?

6. Какие бактерии называются бациллами?

7. Какое строение имеют бактерии вирусы, грибы и простейшие?

8. В чем заключается принцип окраски по Граму, окраски капсул, спор, негативной окраски?

9. Как измеряют микроорганизмы?

магазин запчастей к бытовой технике на заказ