ЛАБОРАТОРНЫЕ ЗАНЯТИЯ

Приготовление бактериологических сред. Приготовить обычные питательные среды. 2. Приготовить специальные и цветные среды. 3. Освоить методы стерилизации сред.

Оборудование и материалы: из расчета на четырех учащихся нужно иметь 150 г мяса говядины, сухой пептон, сухой агар, сухую желатину, свежее снятое молоко, картофелину, поваренную соль, 4%-ный раствор NaOH, технические или аптекарские весы, четыре колбы объемом 250 мл, пробирки, воду, газовые горелки (или примусы, электрические плитки); автоклав, аппарат Коха и печь Пастера.

Бактериологический метод, или метод чистых культур, позволяет определять микроорганизмы по физиологическим свойствам. Для выращивания микробов применяют обычные цветные и специальные питательные среды. На обычных средах растет большинство бактерий. К ним относятся мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонная желатина (МПЖ), молоко и картофель.

Приготовление обычных питательных сред. МПБ. На 500 г изрубленного говяжьего мяса, очищенного от костей, сухожилий, жира и пленок, берут 1 л воды, кипятят 40—60 мин, выжимают через марлю, доливают воду до первоначального объема, прибавляют 1% пептона и 0,5% поваренной соли и кипятят 15 мин. Устанавливают рН среды 7,6—7,8, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 30 мин.

МПА. В готовый МПБ добавляют 3% нарезанного агара, агар расплавляют в текучем паре в аппарате Коха, устанавливают рН 7,6, осветляют яичным белком, фильтруют в аппарате Коха, стерилизуют 30 мин при 120°.

МПЖ. В МПБ нарезают 10% (зимой) или 15% (летом) желатины, расплавляют на водяной бане, доводят рН до 7,6, очищают яичным белком, фильтруют через смоченный бумажный фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют в течение трех дней при 100°С по 30 мин или один раз в автоклаве при 112°С в течение 20 мин.

Молоко. Снятое молоко разбавляют на 2/3 водой, фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 30 мин.

Картофель чистят, удаляют глазки, режут квадратами, клиньями или ломтиками, держат 20—30 мин в 1%-ном растворе питьевой соды, стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 30 мин.

Приготовление специальных и цветных сред. Специальные среды предназначаются для микроорганизмов, не растущих на обычных средах.

Сывороточные мясопептонный агари бульон. К обычному МПА рН 7,2 добавляют стерильно 10% лошадиной сыворотки. Обычно сыворотку лошади заготавливают один раз в 3—6 мес и хранят ее в темном месте при температуре 2—6 °С. По мере надобности эту сыворотку добавляют к бульону или расплавленному и охлажденному до температуры 45—50 °С мясо-пептонному агару. Например, в каждую пробирку с расплавленным и охлажденным агаром добавляют стерильной пипеткой по 0,5 мл сыворотки. Приготовленные среды проверяют на стерильность.

Картофельный агар. К одной части очищенных картофельных ломтиков добавляют две части водопроводной воды, варят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и к фильтрату, имеющему показатель рН 6,8, добавляют 3% агара. Среду стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 30 мин. Проверяют на стерильность.

Сусловый агар. Неохмеленное (сладкое) пивное сусло, которое получают на пивном заводе, нагревают до 110°С и фильтруют через марлю. Доливают воды до показания ареометра 1,03—1,08, добавляют 3% агара, варят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют в текучепаровом аппарате Коха 3 дня по 30 мин.

Синтетический агар для энтомофторовых грибов (не растущих на сусловом агаре). Берут бидистиллированной воды 1 л, глюкозы 20 г, аспарагина 3 г, сернокислого магния 0,5 г, фосфорнооднокалиевой соли (КН₂РО₄) 0,6 г, фосфорнодиухкалиевой соли (К₂НРО₄) 2,4 г. Устанавливают показатель рН 6,0. В случае надобности добавляют 3% агара. Стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 30 мин.

Мясопептонно-сусловыи агар. Нейтральный МПЛ смешивают пополам с сусловым агаром, разливают по пробиркам и дробно стерилизуют.

Сусловый агар с питательной солью для Ascosphaera apis. Берут агара 2 г, пивного сусла 97,9 г и добавляют 0,1 г питательной соли. [Состав соли: 40% КН₂РО₄, 40% NH₄NO₃, 19,9% MgSO₄, и 0,1% Fе₃(РО₄)₂].

Цветные среды готовят для определения у изучаемых микробов ферментов на углеводы, что необходимо для определения их вида. Они делятся на жидкие и плотные. Жидкие цветные среды готовят из пептонной воды, индикатора Андредэ и какого-либо одного углевода.

Индикатор Андредэ: 0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл дистиллированной воды, добавляют 16,4 мл нормального раствора едкого натрия и стерилизуют 5 мин при 110 °С, Индикатор имеет цвет слабо заваренного чая.

Жидкие цветные среды типа Барсикова. К 300 мл дистиллированной воды добавляют пептона 1%, поваренной соли 0,5%, индикатора Андредэ 1%. Разливают в небольшие колбы по 100 мл и в каждую добавляют по 1 г одного из следующих углеводов: глюкозы (Барсиков I), лактозы (Барсиков II), маннита (среда Гетча). По этому типу готовят среды с добавлением одного из следующих углеводов: арабинозы, дульцита, ксилозы, сорбита и др. Дробно стерилизуют. Среды имеют соломенно-желтый цвет без розового оттенка. Хранят в темноте.

Бульон Штерна. В 100 мл бульона (рН 7,6) растворяют 1 мл глицерина, добавляют 5—6 капель фильтрованного насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл свежеприготовленного 10%-ного водного раствора сернистокислого натрия. Разлитую по пробиркам среду стерилизуют дробно или при 110°С 30 мин. Готовый бульон золотистого цвета. При долгом хранении и при действии света среда краснеет, что делает ее непригодной для работы.

Плотные цветные среды. Агар Конради-Дригальского. К 100 мл расплавленного 3%-ного слабощелочного агара (рН 7,6) прибавляют лактозы 1,5 г и после ее растворения добавляют 1 мл водного 0,1%-ного раствора кристаллвиолета и 13 мл лакмусовой настойки. Среду разливают по колбам, дробно стерилизуют при 100 °С 3 дня по 15—20 мин. Хорошо приготовленная среда имеет синий цвет с фиолетовым оттенком.

Агар Эндо. К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,6) добавляют лактозы 1 г, спиртового насыщенного основного фуксина (после фильтрования) 0,5 мл и 2,5 мл свежеприготовленного 10%-ного водного раствора сульфита натрия (сернистокислый натрий).

Среду разливают по колбам и дробно стерилизуют. В горячем виде агар слабо-красного цвета, а в холодном — чуть розоватого (цвет человеческой кожи). Иногда сульфита натрия приходится добавлять немного больше, так как препарат бывает в продаже неодинакового качества. Среду хранят в темноте.

Конгорот агар по Либерману и Ацелю. К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,6) прибавляют 1,5 г лактозы и 10%-ного водного профильтрованного раствора конгорот 3 мл, стерилизуют дробно. Среда красного цвета. При хранении (длительном) краска выпадает в виде черных взвешенных частичек.

Нейтральрот агар Ротбергера. К 100 мл расплавленного МПА агара (рН 7,6) прибавляют 0,3 г глюкозы и 1 мл насыщенного водного раствора нейтральрота. Среду разливают по пробиркам высоким столбиком и дробно стерилизуют. Цвет среды вишневый.

Получение чистых культур бактерий. Произвести посев бактерий на плотную среду.

Оборудование и материалы: для каждого учащегося готовит по одной пробирке со скошенным МПА, чашку с колониями бактерий, пробирку со стерильным раствором, бактериологическую петлю, спиртовку, предметные стекла, фильтровальную бумагу, микроскоп, кедровое масло, карандаш по стеклу, банку с 2%-ным раствором фенола.

Получение чистой культуры и посев ее на питательные среды. Получение чистой культуры (состоящей из одного вида) бактерий производят методом фракционированного (дробного) посева. Микроорганизмы высевают на среды около горящей спиртовки. В пламени ее фламбируют (стерилизуют) бактериологическую петлю и обжигают края пробирок при их открывании и закрывании пробками. Внесенный петлей в чашку Петри или пробирку с МПА или со специальной средой патологический материал распределяют волнообразной линией легким прикосновением по поверхности среды и ставят в термостат.

Для анаэробных микроорганизмов создают бескислородные условия. Для этого чашки или пробирки ставят в эксикатор с хорошо притертой крышкой или под колокол с притертым дном. Дно колокола смазывают вазелином, чтобы не было подсасывания воздуха. Кислород из этих приборов удаляют или выкачиванием, или замещением индифферентным газом (азотом, водородом), или химическими реакциями. Один из распространенных способов удаления кислорода — поглощение его горением. В эксикатор ставят чашку со спиртом. Спирт поджигают и сразу же закрывают крышку. При горении спирта содержание кислорода значительно снизится и возрастет содержание углекислоты. Однако этот прием не позволяет полностью удалить кислород. Для полного удаления кислорода берут на 1 л объема эксикатора 30 г гидросульфита натрия (Na₂S₂O₄) и 30 г углекислого натрия (Nа₂СО₃). Эти препараты смешивают и увлажняют водой и сразу же закрывают эксикатор.

Засеянные чашки или пробирки ставят в термостат при температуре 37°С (и при более низкой). На следующий день или через двое суток по ходу посева образуется рост, а в конце линии — отдельные колонии.

Колонии, как правило, вырастают из одной клетки и поэтому составляют начало чистой культуры. Из колонии делают отвивку и сеют эту культуру на обычные или специальные среды.

Контрольные вопросы.

1. Как питаются микроорганизмы?

2. Как делятся микроорганизмы по типу питания?

3. Дайте характеристику прототрофов, метатрофов и паратрофов.

4. Каковы источники азотистого питания микроорганизмов?

5. Что такое плазмолиз и плазмоптис, в каких условиях происходят эти явления?

6. В чем заключается сущность дыхания?

7. В чем состоит сущность аэробного и анаэробного дыхания?

8. Как делятся ферменты, что такое брожение?

9. Каково назначение питательных сред обычных, специальных, цветных?

10. Как выращиваются анаэробные бактерии?

11. Какие среды относятся к обычным? Назначение каждой из этих сред.