ЛАБОРАТОРНЫЕ ЗАНЯТИЯ

Экспериментальное заражение насекомых. 1. Приготовить материал и опытных насекомых для заражения. 2. Заразить насекомых.

Оборудование и материалы: живые взрослые пчелы, 1%-ный раствор йода, ватные тампоны на спичках, иглы в иглодержателях, стерильные фарфоровые ступки, пинцеты, марлево-ватные фильтры в маленьких воронках, стерильный физраствор в пробирках, спиртовки, стерильные пастеровские пипетки, набор красящих растворов, обезжиренные предметные стекла, микроскопы, эксгаустер.

Подготовка материала и опытных, насекомых для заражения. Опытные заражения пчел или других насекомых позволяют определить заразительность болезни и патогенность микроба и изучить длительность и симптомы (признаки) экспериментально вызванной болезни. Подопытных насекомых заражают чистой культурой микроорганизма или патологическим материалом.

Патологический материал берут от больных пчел (трупы или органы пчел, личинки) или других насекомых (шелкопряды, восковая моль, жуки-кожееды и др.), заливают небольшими порциями стерильного физраствора, тщательно растворяют в стерильной фарфоровой ступке, фильтруют через марлево-ватный фильтр. Полученным фильтратом заражают насекомых.

Чистую культуру микроба перед заражением смывают с плотной среды физраствором, разбивают стерильной бактериологической петлей комочки, встряхивают, в случае надобности фильтруют. Фильтрат используют для заражения.

В зависимости от поставленных задач для опытных заражений берут полноценные пчелиные семьи, небольшие семьи только одних взрослых пчел или одних пчелиных личинок. Пчел отбирают эксгаустером.

Часто заражают и другие виды насекомых. В полноценных семьях предварительно учитывают силу семьи, возраст матки, количество расплода, сотов, меда, перги.

Чаще создают для опытных целей небольшие пчелиные семьи (в улейках на 1/4 рамки) из 100 или 200 г молодых пчел и 1 — 2-дневных личинок в сотах. Нередко берут для тех же целей группы взрослых пчел (10, 20 или 50 г) определенного возраста (однодневных, нелетных, летных), сажают их в картонные цилиндры размером 10×10 см и ставят на стеклянное дно; верх цилиндра закрывают марлей, которую в натянутом виде прихватывают резиновым кольцом. Кормят пчел сиропом или медом.

Личинок медоносной пчелы выращивают при температуре 3—4°С и относительной влажности 75—85%. Содержат личинок индивидуально на часовом стекле или в чашках Петри. На дно чашки Петри кладут слой гигроскопической ваты толщиной 3—4 мм. Вату пропитывают раствором, содержащим 25% меда и 10% сухого экстракта дрожжей. Вату покрывают сверху слоем марли, которую плотно прижимают к вате. Сверху марли кладут личинок рабочих пчел в возрасте 3—5 дней. Марля предохраняет личинок от погружения в жидкость. Личинки, поедая такую питательную среду, быстро растут. Наиболее благоприятным кормом для личинок служит маточное молочко, которое хранят в холодильнике. Личинок с помощью платиновой петли через каждые 2 ч кормят. Маточное молочко кладут возле личинки.

Других насекомых (гусеницы восковой моли, шелкопряды и пр.) содержат в энтомологических садках и дают им соответствующий корм.

Во всех случаях, кроме подопытных групп насекомых, создают такие же контрольные группы. Им вместо испытуемого материала дают или вводят физраствор. Содержатся они в тех же условиях, что и подопытные.

Заражение насекомых. Применяют разные способы заражения, а именно: алиментарный — с кормом, к которому добавляют фильтрат патологического материала или смывы чистой культуры микроорганизма; респираторный (respiratio — дыхание) — через органы дыхания и покровные ткани, путем опрыскивания из пульверизатора фильтратом или смывом культуры; парентеральный (минуя кишечник) — в полость тела вводят патологический материал тонкой иглой или пипеткой через межсегментарные перепонки. Место введения до и после операции смазывают миниатюрным влажным тампоном, смоченным 1%-ной йодной настойкой.

За зараженными и контрольными насекомыми ведут регулярные наблюдения. Интервалы между наблюдениями могут быть различными в зависимости от быстроты развития привитой болезни. При быстро протекающей болезни наблюдения ведут через 2—3 ч, а при хронической, длящейся неделями, — один раз в сутки. При осмотрах отмечают поведение насекомых, их вид, сроки гибели, расходование и пополнение корма и пр. Одновременно отмечают окружающую температуру и влажность.

На ход и развитие инфекции среди насекомых сильное влияние оказывают температурные условия и влажность. Поэтому часто подопытные и контрольные пары содержат при разных температурах и разной относительной влажности. Обычно повышение температуры и относительной влажности способствует развитию инфекционной болезни.

Исследование подопытных насекомых. 1. Произвести посевы из насекомого. 2. Зафиксировать и вскрыть больное насекомое.

Оборудование и материалы: зараженные пчелы или другие насекомые, 1%-ный раствор йодной настойки, ватные тампоны, стерильные пипетки для взятия гемолимфы, бинокулярные лупы, препаровальные иглы, ванночки, скальпели, пинцеты, булавки, пипетки с резиновой грушей, органическое стекло, растворенное в хлороформе.

Микробиологическое исследование. Больных и погибших насекомых подвергают микробиологическому исследованию. Из их тканей и органов производят высевы на питательные среды и готовят мазки для микроскопии. Патогенные микроорганизмы легче выделять из больных, еще живых насекомых и труднее — из погибших, подвергшихся разложению. При высевах из живых пчел материал для посева берут из гемолимфы и внутренних органов. Такие же вытевы делают из контрольных насекомых. Место взятия (брюшко, грудь) предварительно дезинфицируют йодной настойкой.

Гемолимфу берут капиллярной или тонкой пастеровской пипеткой из брюшка с дорзальной (спинной) стороны, прокалывая сочленения между тергитами. При посеве из мышц делают при соблюдении стерильности надрезы хитина с дорзальной стороны груди насекомого. Взятый материал засевают на плотные питательные среды. Из тех же тканей и органов делают мазки па предметные стекла.

Нередко производят высевы и мазки из внутренних органов: мальпигиевых сосудов, половых органов, желез и пр. Для этих целей насекомое предварительно обильно обмывают стерильным физраствором, затем погружают в этиловый спирт и снова обмывают стерильным солевым раствором, после этого фиксируют и вскрывают.

Фиксация насекомых. На середину дна сухой стерильной чашки Петри наносят каплю растворенного в хлороформе плексигласа (органического стекла). В эту каплю сразу кладут насекомое, слегка прижимают стерильной иглой и держат так около полминуты до загустения жидкости. Затем оставляют насекомое на 5-7 мин до подсыхания органического стекла. Насекомое будет прочно закреплено. Фиксируют насекомых и путем погружения их конечностей в слегка расплавленную смесь воска и парафина (смесь заранее наливают в стерильную чашку Петри). Можно фиксировать на лейкопластыре или изоляционной ленте, погружая ножки, брюшко и грудь насекомого в клейкую массу. Ленту лейкопластыря прикрепляют ко дну ванночки. Можно фиксировать насекомых и булавками, которыми пронзают голову и заднюю часть брюшка насекомого. Булавки вставляют в сильно наклоненном положении, с тем чтобы они не мешали вскрытию насекомого.

Вскрытие. Скальпели берут малых размеров цельнометаллические, предназначенные для глазных операций. Они должны быть острыми. Их точат на мелкозернистом бруске, смоченном водой. Хорошо отточенный скальпель правят на оселке с добавлением капли масла. Окончательную правку скальпеля производят на бритвенном ремне. После работы скальпель снова точат, правят, насухо вытирают и лезвие обертывают ватой.

Ножницы препаровальные берут небольшие, глазные, острые. Режущие части ножниц должны быть тонкими, прочными, острыми и соприкасающимися на всем своем протяжении. Концы при сжатии ножниц должны быть одинаковой длины и не заходить один за другой. Разборные ножницы удобнее, так как легко подвергаются вытиранию и просушиванию, После работы их разбирают и тщательно вытирают.

Пинцеты должны быть небольшие, остроконечные, легко поддающиеся сжатию. С помощью пинцета захватывают, приподнимают и удаляют наружные покровы, отделяют органы, переносят нужные объекты на предметное стекло и пр.

Препаровальные иглы применяют обычные, копьевидные и лопатовидные. Они также должны быть острыми с металлическими иглодержателями. Обычно иглы легко можно приготовить самому из ученических ручек и швейных иголок. С ученической ручки удаляют металлическую часть, предназначенную для держания пера. В центр деревянной ручки с помощью клещей вставляют тупым концом швейную иголку. Обычные иглы остро оттачивают напильником, а затем на бруске так, чтобы профиль их от середины иглы до конца спускался конусообразно.

Пипетки с резиновыми грушами применяют для промывания струей воды внутренних органов, их используют также для смены водно-солевого раствора и пр.

Булавки для прикалывания изучаемых объектов ко дну ванночки должны быть тонкими и острыми. После окончания работы весь инструментарий заново оттачивают, моют, насухо вытирают и хранят в сухом месте. Перед началом работы инструментарий стерилизуют в стерилизаторе.

Вскрытие насекомых производят стерильным инструментом в стерильном солевом растворе; у насекомого отрезают крылья и надкрылья. Ножницами с боков, начиная с заднего брюшного конца до переднего конца брюшка, а иногда и до головы, надрезают брюшные покровы, затем делают поперечные надрезы у первого сегмента брюшка или позади головы и у заднего конца брюшка; покров, начиная с заднего конца, осторожно поднимают пинцетом и отпрепаровывают скальпелем, препаровальным копьем или иглами.

Препарируют насекомое под препаровальной лупой при сильном падающем или проходящем свете. При падающем свете исследуют непросвечивающиеся объекты, а в проходящем — просвечивающиеся.

Отпрепарованная дорзальная хитиновая часть брюшка с внутренней стороны имеет сердце. При первых надрезах покровной ткани насекомого гемолимфа вытекает наружу.

После удаления с брюшка хитинового покрова сверху и в пространствах между органами видна рыхлая зернистая ткань — жировое теле. Трахейная система у взрослых насекомых представлена двумя расположенными вдоль брюшка воздухоносными мешками. От них отходят разветвления — трахеи и трахеолы. Трахеи имеют спиралевидное строение. Наполненные воздухом, они имеют в воде серебристо-белый цвет. При проникновении в них воды они становятся прозрачными. Мелкие разветвления трахей и трахеол пронизывают каждый орган членистоногого. Основные стволы группы трахей исследуют под бинокулярной лупой или при слабом увеличении микроскопа.

После удаления жирового тела в задней части брюшка открываются половые органы самца и самки, становится видной пищеварительная система, представляющая объемистую трубку с расширениями. От головы через грудь идет пищевод, затем пищеварительный желудок, мальпигиевы сосуды, задняя кишка. Пищеварительный желудок наиболее часто подвержен изменениям под влиянием инфекционных и инвазионных болезней.

Нередко исследуют у насекомых только одну пищеварительную систему. В таких случаях кишечник извлекают у него без вскрытия. Насекомое наркотизируют или умерщвляют путем сдавливания пальцами грудной части. Затем берут за спинку большим и указательным пальцами левой руки так, чтобы ножки были направлены вверх, а брюшко — в сторону правой руки и пинцетом, находящимся в правой руке, захватывают с боков последний сегмент брюшка. Извлечение кишечника у гусениц производят так: отрезают голову и последний сегмент. Затем захватывают пинцетом кишечник и извлекают его.

Кишечник мелких насекомых (тлей) извлекают на предметном стекле, помещенном на темном фоне, извлечение кишечника производят в капле физраствора. Головной конец тли придерживают шпателем. Иглой или препаровальным копьем отделяют брюшко и извлекают кишечник. Таким же путем можно извлекать слюнные железы.

Серологическая диагностика болезней пчел. 1. Изучить реакции преципитации и агглютинации. 2. Изучить диагностику флуоресцирующими антителами.

Оборудование и материалы: специфические сыворотки и контрольные антигены для реакции преципитации и реакции агглютинации, асбестовая вата, маленькие воронки и пробирки (0,55 см.), предметные стекла, раствор, пастеровские пипетки, пипетки градуированные 1 мл, специфические сыворотки, меченные флуоресцином, флуоресцентный микроскоп.

Серологические (serum — сыворотка) реакции основаны на специфичности антигена и антитела. Они имеют большое практическое значение, позволяя по известному антителу, т. е. специфической сыворотке (приготовленной путем иммунизации кролика каким-либо известным эитомопатогенным микробом), определять неизвестного энтомопатогенного микроба и причину гибели насекомого. Для диагностики болезней пчел и шелкопрядов используют наиболее часто следующие серологические реакции: реакцию преципитации, реакцию агглютинации и флуоресцирующие антитела.

Реакция преципитации. Преципитация (precipitatio — быстрое осаждение) представляет собой выпадение белка в осадок при соединении прозрачных сывороток и антигена. Сыворотку берут прозрачную, неразведенную, на которую наслаивают хорошо отфильтрованный прозрачный антиген. Для диагностики американского и европейского гнильца антиген готовят из 10 погибших от гнильца личинок, кладут их в ступку, добавляют туда же десятикратное количество физраствора (15 мл для взрослых личинок и 7 мл для 3—4-дневных личинок). Личинок тщательно растирают, суспензию нагревают на кипящей водяной бане 15 мин и фильтруют через асбестовую вату до получения прозрачного экстракта.

Реакцию преципитации ставят в небольших пробирках диаметром 0,4—0,5 мм и высотой 5—7 см. В одну пробирку наливают небольшое количество (0,3—0,4 мм) прозрачной, хорошо отфильтрованной через асбест специфической сыворотки против американского гнильца (антиларвейная сыворотка), в две другие — специфические сыворотки против европейского гнильца (антиплютоновая и антиальвейная сыворотки), сверху на эти сыворотки осторожно наслаивают прозрачный экстракт. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 15 мин. При положительной реакции образуется, обычно уже спустя 0,5—2 мин, на границе между сывороткой и испытуемым экстрактом тонкое нежное голубовато-матовое кольцо. Реакцию преципитации сопровождают контролями: а) испытуемый экстракт с нормальной сывороткой (должна быть отрицательная реакция); б) со специфическими антигенами (положительная реакция). В том случае, если испытуемый экстракт даст положительную реакцию с антиларвейной сывороткой, ставят диагноз — американский гнилец, если испытуемый экстракт даст положительную реакцию с обеими или с одной из сывороток против европейского гнильца, ставят диагноз — европейский гнилец. При положительной реакции с антиларвейной сывороткой и с одной.или обеими сыворотками против европейского гнильца ставят диагноз — смешанная инфекция европейского гнильца.

Реакция агглютинации. Агглютинацией (agglutinatio — склеивание) называют склеивание бактерий под влиянием специфической сыворотки в присутствии электролитов (солей среды). Реакцию агглютинации ставят, соединяя различные разведения специфической сыворотки (антитела) со взвесью бактерий (антигены). Реакцию ставят в пробирках, в таких случаях учет результатов производят через сутки и на предметном стекле, соединяя каплю разведенной специфической сыворотки и каплю антигена. Учет реакции производят через 3—5 мин. Реакция агглютинации при постановке на стекле в каплях носит название капельной агглютинации.

Капельная реакция агглютинации применяется для диагностики американского гнильца. Для ее постановки из исследуемого образца сота берут 10 погибших личинок, кладут в фарфоровую ступку, добавляют 10 мл физраствора, тщательно растирают, фильтруют через вату, фильтрат подогревают до 80 °С и в горячем виде дополнительно фильтруют через бумажный фильтр, центрифугируют 10—15 мин при 2500 оборотах; жидкость сливают, осадок берут по одной бактериологической петле как испытуемый антиген.

В различные места чистого обеззараженного предметного стекла наносят пастеровской пипеткой две капли антиларвейной сыворотки; одну в разведении 1:200, вторую — 1:400. К ним добавляют по одной петле испытуемого антигена. Реакция протекает при 37 °С. При положительной реакции в течение 3—5 мин происходит полное просветление жидкости и скучивание микробов в виде комочков. Контроля этого микробного антигена с аналогичными разведениями нормальной сыворотки и физраствором не просветляют жидкость и не образуют хлопьев.

Реакцию агглютинации ставят также для быстрого определения энтомопатогенных бактерий. В этих случаях берут определенные специфические сыворотки.

Диагностика флуоресцирующими антителами. Быстрый и точный диагноз бактерийных, риккетсиозных и некоторых других болезней насекомых достигается при исследовании в люминесцентном микроскопе свечения возбудителей болезней, вступивших в серологическую реакцию со специфическим антителом, окрашенным (меченным) изотиоцианатом флуоресцеина (флуорохромом). Специфические антитела к возбудителю какой-либо болезни получают из специфической сыворотки путем высаливания из нее глобулина сернокислым аммонием. Очищенный от соли путем диализа глобулин, содержащий антитела, окрашивают красителем изотиоцианатом флуоресцеина и лиофильно высушивают. Мазки из тканей больных или погибших насекомых, сделанные на чистом, обеззараженном предметном стекле, фиксированные ацетоном, обрабатывают окрашенным (меченым) глобулином в разведении 1:2 и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа. При наличии в мазках из тканей специфического к меченым антителам антигена последний приобретает свечение различной четкости и окраски.

Контрольные вопросы.

1. Что такое инфекция?

2. Какой исход инфекционного процесса и почему?

3. Какие существуют различия между сапрофитами и паразитами?

4. Что такое патогенность и вирулентность?

5. Как определяется вирулентность микробов и чем она обусловливается?