предыдущая главасодержаниеследующая глава

ЭСТАФЕТУ ПРИНИМАЕТ АВТОР

(Чудесный метод. — Загадка цветовых пятен. — Небольшие «уступки» прополиса.)

К 60-м годам текущего столетия о прополисе уже было накоплено немало биологических данных, но его химическая природа оставалась крайне мало изученной. Предстояло найти какие-то привязочные, в первую очередь химические координаты пчелиного клея. Этой работой я со своими помощниками занялся в 1963 году в одной из лабораторий Института химии природных соединений АН СССР (в 1974 году он был переименован в Институт биоорганической химии имени М. М. Шемякина).

Собрав большое число образцов прополиса из самых различных районов страны, мы подвергли их тщательному исследованию методом хроматографии.

О хроматографии следует рассказать подробнее. Этот метод, открытый более 70 лет назад русским ботаником М. С. Цветом (1872—1919), буквально преобразил лицо современной химии, сделав работу химика более изящной и увлекательной.

Если раньше, стремясь выделить какое-либо соединение, химик мечтал получить его в кристаллической форме, то теперь вещества стали представать перед его глазами в виде играющих всеми цветами радуги пятен на хроматографических пластинках.

С явлениями хроматографии мы иногда сталкиваемся и в обычной жизни. Например, когда неосторожно капнем на белое платье или скатерть красным вином, соком вишни или другой спелой ягоды.

Что при этом происходит?

Красящие зоны, расходясь концентрическими кругами, впереди окаймляются бесцветной полоской, в которой перемещается вода, а в случае с вином — ее смесь со спиртом. Если мы заинтересуемся этим явлением и, продолжив наблюдения, дополнительно капнем в центр пятна водой или другим растворителем, то красящие зоны слегка продвинутся, а бесцветная убежит еще дальше от центра. По сути это и есть эффект хроматографии в тонком слое (ТСХ).

Представим теперь, что мы в химической лаборатории, где идет процесс разделения смеси веществ. Химики для таких целей берут, конечно, другие материалы. Особенно широкое применение получила кремниевая кислота, или силикагель. Кремниевая кислота — не что иное, как речной песок, но ее гранулы еще содержат воду. Сам речной песок хроматографически мало активен, и его нельзя использовать, например, для выведения пятна на скатерти. Чтобы получить более активную форму адсорбента (поглотителя), кремниевую кислоту осаждают в виде студнеобразного геля и высушивают в определенном режиме. Растерев белоснежные гранулы в порошок и просеяв его через специальные сита, получают однородные по размеру частицы фракции — материал, который можно использовать для хроматографии. Для ее тонкослойного варианта, особенно полюбившегося химикам, порошки адсорбента наносят ровным слоем на пластинку, сделанную из стекла или алюминиевой фольги.

Исследуемую смесь веществ растворяют в ацетоне или спирте и тонким стеклянным капилляром, слегка касаясь поверхности адсорбента, наносят раствор в заранее размеченные точки. Активированные частицы силикагеля быстро впитывают в себя столбик капиллярной жидкости вместе с растворенным в ней веществом, образуя небольшое пятнышко исходной зоны.

Пластинку затем помещают в специальную стеклянную камеру, представляющую собой герметически закрытый сосуд, на дно которого налита нужная для деления смесь растворителей или, как ее называют, система. При погружении края пластинки в жидкость система впитывается контактирующими друг с другом частицами адсорбента и начинает перемещаться вверх, то есть приводится в действие механизм, аналогичный тому, что поддерживает огонь в керосиновой лампе. Вещества иногда можно разделить и при помощи очищенного керосина, но лучше специально подобрать систему. Лучшая система та, в которой компоненты исследуемой смеси как можно дальше отделяются один от другого при прохождении по пластинке бегущего вала, или фронта растворителей.

Редкое застолье обходится без пятен на скатерти
Редкое застолье обходится без пятен на скатерти

Когда такой фронт проходит через участок, где «сидят» молекулы нанесенного вещества, последние обретают подвижность и, увлекаемые током растворителей, перемещаются вслед за ними. Частицы адсорбента, однако, препятствуют этому процессу, задерживая «увлеченную» молекулу. В результате устанавливается некое равновесие, и величина пробега потревоженной молекулы по пластинке будет зависеть от того, к чему у нее большее влечение (или сродство) — к растворителю или к частицам белоснежного вещества — адсорбента.

Некоторые молекулы «не изменяют» приютившему их адсорбенту, совершенно не увлекаются растворителем и остаются на месте. Другие же, обычно более легкие, — «бегут» почти вместе с прокатывающимся по пластинке валом жидкости. Искусство химика и состоит в подборе адсорбента и системы таким образом, чтобы интересующие его молекулы вещества в меру увлекались растворителями и не слишком «засиживались» па неподвижных частях адсорбента.

Для оценки такой меры химики условились ввести величину хроматографической подвижности (Rf), которая выражается отношением длины пробега вещества к длине пробега фронта растворителей. У вещества с Rf, равной 0—0,1, хроматографическая подвижность мала, при Rf 0,9—1,0, наоборот, слишком велика.

Наблюдательные химики выявили, что на «сортировку» молекул по поверхности адсорбента можно влиять извне, меняя растворитель и сам адсорбент, и тогда «отстающие» молекулы могут выйти в «передовые». Это и создает химику необычайные возможности, и он, овладев хроматографией, чувствует себя хозяином положения.

Однако продолжим наш опыт. Смесь растворителей, пропитав миллиметр за миллиметром нанесенный на пластинку адсорбент, достигла, наконец, края пластинки. В этот момент пластинку надо вынуть из камеры и, подсушив ее на воздухе, увидеть те места, которые заняли молекулы после проведенного «соревнования на подвижность». До этого все они находились в одной «компании», как бегуны на старте, теперь же одна молекула, побольше и потяжелее, отстала от более легких, другая, хотя и небольшая, содержала в себе активные группы (гидроксил, карбоксил, аминогруппу), за которые «цеплялся» адсорбент, не позволяя ей развить большую хроматографическую скорость, и тоже отстала.

Так или иначе, устроив молекулам «бег с препятствием» по белоснежной пластинке, химик теперь должен объективно оценить подвижность каждой, измерив величину Rf .

Беда, однако, в том, что не все «ожившие» в хроматографической сосуде молекулы, переместившись на пластинке, спешат «заявить» о своем новом местоположении. К тем же, которые не скрывают своего «жительства», относятся, например, пигменты растений. На пластинке их видно сразу по цветным пятнам.

Отдельную молекулу мы увидеть не можем, в массе же они заметно меняют характеристики падающего на них света, что и улавливает наш глаз, обнаруживая их скопления как отдельное пятно.

Те молекулы, которые меньше меняют свойства видимых нами участков света, приходится обнаруживать другими способами. Химик снова начинает изощряться, ведя беспрерывное наступление на вещество. Он несет пластинку под лампу ультрафиолетового света и там непременно обнаружит для себя что-то интересное. Не успокоившись, он будет опрыскивать пластинку различными реагентами, надеясь, что притаившиеся молекулы-невидимки вдруг выдадут себя в виде цветного пятна.

Последнее очень важно: наш глаз — один из самых высокочувствительных приборов, созданных природой, и определение вещества по цвету пятна представляет собой весьма эффективный метод. При его помощи удается идентифицировать вещество при разбавлении в миллиард раз, что равносильно выливанию одного стакана исследуемой смеси в целое озеро воды!

Вот это и есть чудо хроматографии — метода, который полюбили все: дотошные криминалисты, исследующие улики преступной деятельности нарушителей закона, строгие эксперты, следящие за качеством продукции, санитарно-технический надзор, определяющий состояние окружающей среды, медики, ведущие анализ внутренней среды человека (крови, лимфы, выделений желез).

Хроматография все шире входит в нашу жизнь, у нее — прекрасное настоящее и, как уверяют специалисты, еще более блестящее будущее.

Вот этот метод мы и взяли на вооружение, приступив к исследованию тайн пчелиного лекарства.

Уже первые хроматограммы заворожили нас красотой открывшейся цветовой гаммы: желтые, красные, синеватые и оранжевые пятна, их переливы и оттенки буквально пылали на белоснежном фоне пластинок силикагеля.

Вещества прополиса (прежде чем им вспыхнуть на пластинках) мы разделяли в системах этилацетат — гептан в соотношении 2:3 (или 1:1) или бензол—ацетон (9:1), а потом подставляли под «душ» из концентрированной серной кислоты, пятна от этого делались сочнее по цвету, и число их заметно прибавлялось.

Готовясь к фундаментальному изучению прополиса, мы к этому времени скопили значительную коллекцию его образцов (более сотни), присланных из главных пчеловодных зон страны. Теперь мы могли приступить к их первой физико-химической характеристике.

После просмотра первых десятков хроматограмм выявился поразительный факт: большинство образцов прополиса, отличающихся особо красочной палитрой пятен, были явно похожи друг на друга. В хроматограммах остальной, меньшей, части с более бедными красками преобладали желтые тона. Эти образцы происходили преимущественно из южных районов.

Мы вздохнули с облегчением: тревожащее нас предположение, что прополис — это некий винегрет из всего смолистого, что находит пчела в природе, а потом и «варит» в улье наподобие меда, явно не подтверждалось. Наоборот, у пчел в отношении сбора и приготовления прополиса намечался весьма строгий порядок. Он-то и убеждал нас, что пчелы отводят этому веществу особую роль в улье, и мы с новой энергией углубились в исследования.

Ситуация в целом существенно упрощалась. Теперь можно было временно отодвинуть в сторону второстепенные по распространенности образцы и приступить к исследованию главного, по сути общесоюзного типа прополиса. В самом деле, образцы этого вещества были присланы из центральных лесных и лесостепных районов, Прибалтики, северных и западных частей Украины, Урала, Алтая, Западной и Восточной Сибири. Они встречались также и среди прополиса из более южных, горных районов, например Кавказа, Молдавии.

Сразу трудно было установить, исследуем ли мы тот же образец, что и Мишель Барбье с его группой, не сообщившие привязочных, хроматографических координат взятого образца, или наш прополис относится к южному, менее распространенному типу.

Проанализировав методом ТСХ всю коллекцию, мы установили очень важные факты, однако основной вопрос оставался по-прежнему открытым: откуда же в ульях берется это удивительное вещество? Определенные суждения, правда, могли быть сделаны и на основании первоначальных хроматографических сведений. Так выявились различные по содержанию характерных компонентов образцы, собранные в пределах одной и той же области, например Тульской, Воронежской, Московской. Чаще всего такое различие наблюдалось в областях, переходных от северной лесной зоны к степной южной.

Если бы прополис имел преимущественно «внутреннее» происхождение, то есть был бы продуктом биосинтеза желез самой пчелы или формировался в результате переработки пыльцы, как утверждал Кюстенмахер, он должен был бы давать более однородную хроматографическую картину. Правда, такая картина наблюдалась, но не по всем образцам.

Мы явно исчерпывали ресурсы метода, и дальнейшее продвижение требовало уже точного выяснения химической природы конкретных, причем наиболее характерных компонентов прополиса данного типа. Это означало более глубокое химическое исследование, для которого требовались другие, более трудоемкие и сложные методы.

Следует иметь в виду, что строение веществ, о которых ранее сообщали ученые (Кюстенмахер, Жобер), скорее было угадано, чем доказано. Первое по-настоящему чистое соединение — флавонол галангин — группа М. Барбье выделила из прополиса лишь в 1964 году, то есть спустя 50 лет после первых попыток его химического исследования! Все остальные химические атаки прополис «отбивал» весьма успешно. Поэтому при описании химического состава прополиса в журналах и книгах предпочитали оперировать такими малозначащими характеристиками, как общее содержание эфирного масла, прополисного бальзама и т. д. И эфирные масла, и бальзам могли содержать до сотни различных веществ, и «дело о прополисе» от этого не становилось более ясным.

Мы же, горя желанием разобраться в секретах пчелиной «самообороны», надежды не теряли. Действительно, упорный труд принес свои плоды: вскоре было выделено девять индивидуальных кристаллических соединений, пятна которых при анализе спиртового экстракта на пластинках, судя по их интенсивности, оказались главными. Теперь можно было приниматься за установление химического строения веществ.

Собрав спектры, графики, таблицы, исследователь садится за стол
Собрав спектры, графики, таблицы, исследователь садится за стол

Работа эта — более интересная, хотя и не гарантирующая положительного результата. Она чем-то напоминает решение кроссворда в его срединной части, когда в некоторых клетках будущего слова уже стоят буквы-указательницы. На первых этапах химик стремится как можно быстрее собрать различную физико-химическую информацию о выделенном веществе, затем, имея уже в своем распоряжении спектры, графики, таблицы, усаживается за стол и пытается разобраться в накопившемся материале.

Соединение оставило следы: всплеск осциллографа, отражающего резонанс присутствующих в нем атомов, массу основного осколка, зафиксированного в масс-спектрометре, ультрафиолетовый и инфракрасный спектр и т. д. Остановка за «малым» — совершить качественный скачок от этих конкретных характеристик к единой формуле вещества.

Точный образ, своего рода химический паспорт молекулы — ее формула — вырисовывается обычно постепенно, шаг за шагом. Наконец, когда в голове химика блеснула завершающая идея и он быстро написал на бумаге единственно верную формулу, наступает особо волнующий и ответственный момент: угаданную формулу надо подтвердить.

Наилучший способ — синтезировать это вещество, устроив для себя прямое соревнование с природой. Если вещества окажутся идентичными, радость, испытываемая химиком, заставит его забыть долгие месяцы труда по разделению, очистке соединений и накапливанию информации. Если же синтезированное вещество оказалось другим, все приходится начинать сначала.

Очень много «подводных камней» в работе исследователей «живых молекул». Однако без их точного образа — формулы—важнейшие задачи современной биологии не поддаются решению. Тем более, когда речь идет о биологически активных защитных веществах. Продукты же пчелиной семьи — тема нашего рассказа — особенно захватывающее для химика поле деятельности, где он в полной мере может оценить и свое упорство, и достижения современной науки.

предыдущая главасодержаниеследующая глава













Яндекс.Метрика Рейтинг@Mail.ru

Хаустова Наталья разработка оформления

При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:

http://paseka.su/ "Paseka.su: Всё о пчеловодстве"